Improve gamma-aminobutyricacid production in Corynebacterium glutamicum by optimizing the metabolic fux
通讯作者：王小元，江南大学
发表杂志：Systems Microbiology and Biomanufacturing
发表时间：2021.10
DOI：10.1016/j.biortech.2021.125799
研究背景：
γ-氨基丁酸（GABA）是一种重要的非蛋白类氨基酸，被广泛应用于制药，畜牧，食品添加剂等行业。为了得到高产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌，该研究以C. glutamicum ATCC13032的衍生菌CGY700为出发菌进行了一系列基因改造。
摘要：
本研究通过构建CO2回补反应和过表达柠檬酸合酶来提高CGY700的γ-氨基丁酸产量。质粒过表达ppc和gltA，敲除pknG和ldh，进一步过表达glnA2，获得改造菌CGY-PG-304。CGY-PG-304摇瓶培养可产生41.17g/L的γ-氨基丁酸，补料分批发酵可产生58.33 g/L的γ-氨基丁酸，转化率为0.30 g/g葡萄糖。
研究内容：
一、前期探索工作
乳酸代谢是氨基酸生物合成的主要副产物，而编码L-乳酸脱氢酶的ldh是生物合成乳酸的关键基因。以CGY700为出发菌，敲除ldh得到菌株CGY705，该菌株的GABA产量可达22.40g/L，较出发菌（19.14g/L）提高了17.0%。谷氨酸是GABA合成的主要前提物，而2-酮戊二酸是谷氨酸合成的主要前提物，去磷酸化的OdhI可以抑制2-酮戊二酸脱氢酶的活性，使更多的2-酮戊二酸用于谷氨酸合成。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G（pknG）可以使OdhI磷酸化，因此，在CGY700的基础上敲除pknG使2-酮戊二酸脱氢酶活性降低，得到菌株CGY707，该菌株的GABA产量可达20.84g/L（Fig.2）。
2. ppc和gltA的共表达
柠檬酸的合成是谷棒中TCA循环的限速步骤，而柠檬酸合酶由gltA编码。理论上，通过过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（pck）、丙酮酸羧化酶（pyc）加强丙酮酸羧化反应能够驱动代谢流进入TCA循环。因此，以CGY700为出发菌，共表达大肠来源的ppc1和gltA，分别构建了菌株CGY700-ppc1-gltA，CGY700-pck-gltA和CGY700-pyc-gltA。与出发菌相比，3株实验菌的GABA摩尔产量可达267.27,205.52 和208.56mmol/L（Fig.3）。CGY700-ppc1-gltA表现出了最高的潜在生产力。
由于大肠杆菌来源的ppc1和gltA共表达提高了GABA的产量，我们将这两个基因分别置于不同的启动子Ptac和PtacM下，优化了它们的表达水平。通过编程得到了6种模式，以CGY700为出发菌，构建了CGY700A, CGY700B, CGY700C, CGY700D,CGY700E, 和 CGY700F六株菌（Fig.4）。CGY700E的GABA产率最高，发酵72 h可产16.86 g/L。因此，PtacM-ppc1-Ptac-gltA为**的表达模式，更有利于谷棒中GABA的合成。
3. ldh、pknG、alaT、glnA2突变体的构建
丙氨酸合成和谷氨酰胺合成是谷氨酸合成的主要代谢旁路，其中，alaT编码PLP依赖性转氨酶，glnA2编码谷氨酰胺合成酶。在正常条件下，GlnA2主要催化谷氨酰胺降解为谷氨酸。以CGY700为出发菌，ldh、pknG、alaT敲除、Ptac-glnA2不同组合，构建了CGY705E，CGY707E，CGY708E，CGY709E和CGY710E。其中，与出发菌相比，ldh和pknG共删除的菌株CGY-708E的GABA产量提升最多，增加了86.7%，葡萄糖消耗量增加了54.6%（Fig.5）。
二、有效基因改造的整合
1. 谷棒染色体中共表达ppc2和gltA促进GABA合成
以CGY700为出发菌，采用质粒pCCG1共表达ppc2和gltA构建菌株CGY-PG-100，CGY-PG-200，CGY-PG-300和 CGY-PG-400。摇瓶发酵结果显示，CGY-PG-300（PtacM-ppc2-Ptac-gltA）得到了最高的谷氨酸含量26.36g/L和最高的GABA产量23.63g/L。因此PtacM-ppc2-Ptac-gltA表达模式最有利于GABA合成。与出发菌CGY700相比，CGY-PG-300的GABA产量增加了23.5%（Fig.6）。
2. CGY-PG-300中ldh、pknG、glnA2突变体的构建
以CGY-PG-300为出发菌，通过编程设计，构建ldh、pknG、alaT删除、glnA2过表达不同组合的突变体，得到菌株CGY-PG-301，CGY-PG-302，CGY-PG-303，CGY-PG-304，CGY-PG-305和CGY-PG-306。发酵结果显示，ldh、pknG共删除并过表达glnA2（porB::Ptac-glnA2）的菌株CGY-PG-304的GABA产量最高，增加到了41.17g/L（Fig.7）。
三、发酵工艺优化：在2.4L发酵罐中分批发酵CGY-PG-304
谷氨酸合成的**pH值是6.8-7.5，而GABA合成的**pH值为4.0-5.5。因此，采用基于pH值控制的两步发酵法生产GABA是**的。分批发酵72h后，GABA达到最大产量58.33g/L，收率为0.30g/g 葡萄糖。
